格兰氏染色流程可概括为:染色-脱色-复染.
第一步初染剂(Primary Stain):使用结晶紫染色.
第二步媒染剂(Mordant):加入复方碘溶液或称革兰氏碘液(Gram's Iodine)后会形成不溶性的结晶紫-碘(CV-I)复合体.细菌呈紫黑色.第二步是关键,它的目的是分辨细菌的革兰氏染色特性.若为革兰氏阳性菌,此复合体系结合于细胞壁之镁、核糖核酸组成(Magnesium Ribonucletic Acid),形成镁-核糖核酸-结晶紫-碘(Mg-RNA-CV-I)复合体,不易脱去.
第三步脱色剂(Decoloring Agent):使用酒精(95%)脱色,试剂具脂溶剂(Lipid Solvent)和蛋白脱水剂(Protein Dehydrating Agent)之双重功能.此步骤对革兰氏阳性细菌无效,因为细胞壁上厚厚的细胞壁层阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗,只能留在细菌体内.革兰氏阴性菌细胞壁层薄,会被脱色而成为无色.
第四步复染剂(Counterstain):为了对比,在此之后会加入番红(Safranin)进行复染,革兰氏阴性菌成红色,而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色.
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